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title: 二代测序数据处理（一）数据格式说明 tags: [] id: '1391' categories:

- 组织测序分析 date: 2022-01-17 04:59:34 ---

一、FASTA****(.fa) 储存参考数据集

基本单元
序列所表示的基因名：>ENSMUSG00000020122ENSMUST00000138518，后可接空格表示注释前缀
具体序列信息：CCCTCCTATCATGC……GGGCCCACCTGTTCTCTGGT

基因名独占一行，序列信息为基因名后一行至下一个 > 基因名标记前

>ENSMUSG00000020122ENSMUST00000138518
CCCTCCTATCATGCTGTCAGTGTATCTCTAAATAGCACTCTCAACCCCCGTGAACTTGGT
TATTAAAAACATGCCCAAAGTCTGGGAGCCAGGGCTGCAGGGAAATACCACAGCCTCAGT
TCATCAAAACAGTTCATTGCCCAAAATGTTCTCAGCTGCAGCTTTCATGAGGTAACTCCA
GGGCCCACCTGTTCTCTGGT

FASTA文件为基本单元的简单罗列

>ENSMUSG00000020122ENSMUST00000138518
CCCTCCTATCATGCTGTCAGTGTATCTCTAAATAGCACTCTCAACCCCCGTGAACTTGGT
TATTAAAAACATGCCCAAAGTCTGGGAGCCAGGGCTGCAGGGAAATACCACAGCCTCAGT
TCATCAAAACAGTTCATTGCCCAAAATGTTCTCAGCTGCAGCTTTCATGAGGTAACTCCA
GGGCCCACCTGTTCTCTGGT
>……
……
>ENSMUSG00000020122ENSMUST00000125984
GAGTCAGGTTGAAGCTGCCCTGAACACTACAGAGAAGAGAGGCCTTGGTGTCCTGTTGTC
TCCAGAACCCCAATATGTCTTGTGAAGGGCACACAACCCCTCAAAGGGGTGTCACTTCTT
CTGATCACTTTTGTTACTGTTTACTAACTGATCCTATGAATCACTGTGTCTTCTCAGAGG
CCGTGAACCACGTCTGCAAT
>……
……

二、FASTQ(.fq) 储存原始测序数据

每四行成为一个独立的单元，称之为read；FASTQ文件为read的简单罗列
第一行：以‘@’开头，是这一条read的唯一标识符
第二行：测序read的序列，由A，C，G，T和N这五种字母构成，N代表的是测序时那些无法被识别出来的碱基；
第三行：以‘+’开头，用以兼容旧版格式

第四行：测序read的质量值，Q = -10log(测序错误率)，字符=chr(ord('!')+Q)，上限为 ~

@DJB775P1:248:D0MDGACXX:7:1202:12362:49613
TGCTTACTCTGCGTTGATACCACTGCTTAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAA
+
JJJJJIIJJJJJJHIHHHGHFFFFFFCEEEEEDBD?DDDDDDBDDDABDDCA

三、GTF(.gtf) 描述基因和转录本的信息

GTF文件格式简介

头部有 # 开头的注释行
主体为 \t 分隔的具有九列的表格，空值用 . 填充
第一列 seqid 代表染色体的ID
第二列是 source 代表基因结构的来源
第三列是feature, 代表区间对应的特征类型，如外显子等
第四、五列为区间的起止坐标
第六列是 score
第七列是 strand, 代表正负链的信息, +表示正链，-表示负链，?表示不清楚
第八列是 phase，当描述的是CDS区间信息时，需要指定翻译时开始的位置，取值范围有0,1,2两种

第九列是attributes, 表示属性，键值对间以分号分隔，键值对内以空格分隔

#!genome-build GRCh38.p12
#!genome-version GRCh38
#!genome-date 2013-12
#!genome-build-accession NCBI:GCA_000001405.27
#!genebuild-last-updated 2018-01
1       ensembl_havana  gene    65419   71585   .       +       .       gene_id "ENSG00000186092"; gene_version "6"; gene_name "OR4F5"; gene_source "ensembl_havana"; gene_biotype "protein_coding";

四、IDX(.idx) 基因组比对工具HISAT2的索引文件

RNA-Seq基因组比对工具HISAT2

使用 hisat2-build 工具从.fa文件建立

export FADIR=/opt/human_grch38/dna
export FANAME=Homo_sapiens.GRCh38.dna.chromosome
export IDXDIR=/opt/human_grch38/hisat2_idx

export FILELIST=$FADIR/${FANAME}.1.fa,$FADIR/${FANAME}.2.fa,$FADIR/${FANAME}.3.fa,$FADIR/${FANAME}.4.fa,$FADIR/${FANAME}.5.fa,$FADIR/${FANAME}.6.fa,$FADIR/${FANAME}.7.fa,$FADIR/${FANAME}.8.fa,$FADIR/${FANAME}.9.fa,$FADIR/${FANAME}.10.fa,
export FILELIST=${FILELIST}$FADIR/${FANAME}.11.fa,$FADIR/${FANAME}.12.fa,$FADIR/${FANAME}.13.fa,$FADIR/${FANAME}.14.fa,$FADIR/${FANAME}.15.fa,$FADIR/${FANAME}.16.fa,$FADIR/${FANAME}.17.fa,$FADIR/${FANAME}.18.fa,$FADIR/${FANAME}.19.fa,$FADIR/${FANAME}.20.fa,
export FILELIST=${FILELIST}$FADIR/${FANAME}.21.fa,$FADIR/${FANAME}.22.fa,$FADIR/${FANAME}.MT.fa,$FADIR/${FANAME}.X.fa,$FADIR/${FANAME}.Y.fa
echo **************************************
echo $FILELIST
echo **************************************
hisat2-build -p 8 $FILELIST $IDXDIR/GRCh38.hisat2.idx

五、Sam/Bam(.bam) 记录比对的具体情况

Sam/Bam文件格式详解

六、相关参数说明

基因组的那些事儿

测序深度：30x；每个碱基平均被测次数，相关研究表明5~60x中 30x对于后续分析可以达95%置信度
测序策略：PE150；PE双端测序、一条序列正反测两次；150每次测150bp，双端测一条片段共300bp
350bpcDNA建库：将DNA用超声波随机打断成350bp，加接头，作为测序前的准备工作

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